2021年9月7日，中国科学院北京生命科学研究院李幸团队在国际知名刊物Angewandte Chemie International Edition在线发表了题为Engineering fluorophore recycling in a fluorogenic RNA aptamer的研究论文。该文中，研究人员描述了一种用于西兰花荧光适配体的新型荧光团——TBI。 

　　荧光蛋白存在不可逆的荧光漂白现象，与之相比，荧光响应RNA适配体的特征是能够非共价且可逆地结合同源荧光基团，从而避免荧光漂白，实现荧光恢复。小分子配体与RNA适配体的结合一般涉及三个动力学过程：结合、变构、解离。这三个过程周而复始，构成小分子配体RNA适配体结合和解离的动力学循环，并完成荧光恢复。 

　　2011年康奈尔大学Samie Jaffrey课题组开发出了RNA荧光团DFHBI，但是依然存在光漂白和荧光恢复慢的问题。而进一步发现其光漂白由萤光团快速顺反异构化导致，荧光恢复慢则是由于反式-DFHBI解离慢或者顺式-DFHBI结合慢导致。该课题组在此研究基础上，通过将咪唑酮3位氮原子上引入苯并咪唑基团开发了BI小分子，降低顺反异构化速率并加快解离速率，从而增强了光稳定性。在本研究工作中，研究者在前述基础上进一步将BI萤光团中的咪唑酮2位甲基取代基更换为2-硫羰基 (TBI)，相比之下，光漂白的TBI从西兰花中迅速解离，并且介质中的TBI迅速取代解离的光漂白荧光团，从而增强了荧光稳定性，并有更高的荧光循环率。 

　　在连续成像过程中使用TBI，西兰花细胞中会显示出明显增强的荧光。以上研究数据表明，设计荧光团以优化荧光团循环利用可导致荧光适体的荧光增强。基于循环速率由k_on、k_iso和k_off决定的原理，李幸课题组和合作者在Broccoli RNA晶体结构的指导下发展了一种小分子RNA探针TBI，可高效提升靶标荧光RNA的“循环速率”。TBI可“三管齐下”：1）提高顺式TBI结合Broccoli的k_on、2）降低TBI在Broccoli口袋中的k_iso、3）提高反式TBI脱离Broccoli的k_off。基于此，TBI小分子配体实现了在Broccoli 口袋中的快速循环和缓慢光异构，从而提高光稳定性和荧光RNA信号输出。此外，TBI具有低细胞背景、与Broccoli结合强、增强Broccoli折叠性等特点，从而实现活细胞内RNA的高灵敏追踪。 

　　综上，研究团队系统性地开发了具有低背景、高亮度、高选择性、光稳定、快速探针循环、RNA结合性和折叠性强的RNA成像探针和技术。这种RNA成像手段为解析高等动物体内的RNA时空分布和功能等信息提供了强有力的工具，有助于研究人员深入理解RNA相关生命过程；并有望应用于RNA疾病，如神经退行性疾病、癌症、新冠传染病等疾病的诊断与治疗。此外，该工作的RNA靶向小分子的设计思路为其它小分子配体-生物大分子的设计思路提供了参考。 

　　该工作于2021年9月以Research Article 形式发表于Angewandte Chemie International Edition。李幸研究员为论文的第一作者和共同通讯作者，中国科学院北京生命科学研究院为本文第一单位，合作通讯作者为康奈尔大学医学院药理系Samie R. Jaffrey教授。本研究得到了北京生科院启动基金、美国国立卫生研究院(NIH) R35等基金的支持。 

　　论文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202108338 

 

 

　　

　　图 1. TBI小分子探针的设计思路 

 

　　图 2. 小分子探针TBI在结合 Broccoli RNA时显示出快速的结合速率(k_on)，缓慢的异构速率(k_iso)和快速的解离速率(k_off) 

 

 

　　

　　图 3. TBI小分子在结合RNA时显示出高的循环速率、光稳定性、缓慢光异构和长程成像能力