胞外小囊泡是一种源自胞内体的微小囊泡，具有双层脂质膜结构。它们广泛存在于组织微环境中，携带着丰富且多样的内容物，包括蛋白、脂质和RNA等。研究表明胞外小囊泡的内容物组成与细胞内的相比大有不同，为其在体内发挥重要生物学活性提供了物质基础。在许多生理病理过程中，例如免疫细胞抗原呈递和癌细胞的转移，胞外小囊泡都发挥着关键作用，被认为在细胞间信息交流中充当着“信使”的角色。此外，胞外小囊泡的数量、种类和功能还会受到来源细胞和组织生理状态等因素的影响，进一步增加了其复杂性。然而，目前仍缺乏有效的研究手段来高效解析胞外小囊泡的异质性，以及深入揭示细胞对胞外小囊泡的分泌状态。

2023年12月4日，中国科学院北京生命科学研究院的赵方庆团队在Nature Methods在线发表了题为SEVtras delineates small extracellular vesicles at droplet resolution from single-cell transcriptomes的研究论文。该研究首次建立了胞外小囊泡异质性追踪算法SEVtras，并提出了胞外小囊泡分泌活性指标，以细胞外尺度描绘了不同类型细胞的生理活动状态。通过多次实验验证和对单细胞组学数据的评估，SEVtras被证明能够有效地在单细胞数据中识别胞外小囊泡并准确测量其分泌活性。随后，研究人员将该算法应用于现有的大量单细胞数据集中，系统地描绘了不同类型细胞分泌胞外小囊泡异质性谱系，并发现淋巴细胞的胞外小囊泡分泌活性与胰腺癌侵袭显著相关，可在肿瘤早期作为有力的预测指标，为临床发现潜在标志物打开了新的思路。该研究填补了胞外囊泡组学异质性高通量追踪的空白，为解析海量单细胞转录组学数据提供了独特的“胞外视角”。

 研究人员首先探究了从单细胞转录组测序数据中是否能够识别出胞外小囊泡。他们在未经处理的样本中引入了NanoLuc标记的胞外小囊泡，并在经过单细胞预处理步骤后发现，样本中仍存在大量胞外小囊泡。随后，研究人员分离了胞外小囊泡、大囊泡和细胞碎片，进行了单独的转录组测序。结果显示，胞外小囊泡的转录谱与其他几类存在显著差异，并且能够通过胞外小囊泡基因集的富集来识别。基于这些发现，研究人员设计了一种利用期望最大化算法的胞外小囊泡识别算法，并提出了衡量胞外小囊泡分泌活性的度量指标。为验证算法可靠性，他们进行了三种类型的单细胞实验：1）测量两种细胞系（MSC和293F）的单细胞转录组，并将识别出的胞外小囊泡与实验分离的进行对比；2）在MSC的单细胞样本中添加细胞碎片或大囊泡；3）在MSC的单细胞样本中添加不同比例的实验分离的胞外小囊泡和刺激胞外小囊泡分泌的诱导剂。这些实验证明了SEVtras对胞外小囊泡的特异性识别，使其成为解析胞外小囊泡异质性的有力工具。

研究人员进一步研究了不同细胞分泌的胞外小囊泡的异质性。通过对MSC和293F单细胞转录组数据的联合分析，结果显示不同细胞分泌的胞外小囊泡能够聚集成两个异质性簇，并且与相应的分泌细胞簇相邻。随后，将MSC和293F的细胞以一定比例混合，形成混合样本，并进行单细胞转录组测序。结果表明，SEVtras从混合样本中识别出的胞外小囊泡仍能够形成两个簇，并清晰地追溯回初始的分泌细胞。因此，该方法可用于评估不同细胞类型的胞外小囊泡分泌活性。通过计算得到的MSC和293F的胞外小囊泡分泌活性与单独测序得到的结果接近，再次验证了SEVtras方法的可靠性。

图1. SEVtras可以高效识别单细胞转录组数据中的胞外小囊泡

研究人员将SEVtras应用到近一百个单细胞转录组的数据集（包括15种正常组织和4种肿瘤组织）中，以追踪胞外小囊泡和细胞分泌的异质性。结果发现，在胰腺癌患者中，胞外小囊泡的分泌活性与肿瘤的血管侵袭有显著的关联，尤其是淋巴细胞的胞外小囊泡分泌活性能够在肿瘤早期区分是否侵袭，可具有成为未来临床标志物的潜力。上述结果显示，SEVtras能够从胞外的视角挖掘出数据中隐藏的生物学信息，有助于更深入地理解组织生理病理活动的背后机制。SEVtras能够特异的识别单细胞测序数据中的胞外小囊泡，并且系统揭示了不同类型细胞的胞外小囊泡分泌活性，为目前单细胞转录组分析提供了独特的“胞外视角”。

  中国科学院北京生命科学研究院的何睿乔和朱俊杰为该文的共同第一作者，赵方庆研究员和冀培丰副研究员为该文的共同通讯作者。该项目得到了国家杰出青年科学基金、国家自然科学基金重点项目及科技部重点研发计划项目资助。

         https://www.nature.com/articles/s41592-023-02117-1