活细胞基因组DNA成像可以原位、动态的解析染色体基因组DNA定位和功能，有助于解析染色体的三维组织及其动态信息，时空揭示活细胞染色体生物学功能，剖析相关疾病的发生机制。目前，基于 CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9的基因编辑技术不仅被广泛用于基因组DNA编辑，而且融合荧光探针来成像基因组DNA。这些成像探针主要是催化失活的 Cas9（dCas9）融合荧光蛋白或sgRNA招募荧光蛋白融合的 RNA 结合蛋白（例如dCas9-GFP或者MS2-MCP体系）。然而，这些荧光蛋白都是利用了持续发光的荧光蛋白。因其未与基因组位点结合的荧光蛋白遍布整个细胞核，产生背景噪音荧光，严重干扰基因组DNA成像的效率。此外，这些持续发光的荧光蛋白通常会聚集在核仁中，产生非特异性核仁信号，进一步降低了DNA成像效率。

  为了解决上述问题，中国科学院北京生科院李幸课题组进一步研发了荧光响应fCRISPR (fluorogenic CRISPR)体系，以实现在活细胞中高效精确示踪染色体的功能。该研究以题为Fluorogenic CRISPR for genomic DNA imaging于2024年1月31日发表在Nature Communications 上。fCRISPR可实现荧光蛋白在标记基因组DNA时发光，而不标记基因组DNA时不发光的条件发光特点，从而解决了传统的荧光蛋白标记DNA时出现高背景噪音的问题。此外，fCRISPR示踪了染色体动态的异质性，标记了畸变染色体，并精细观测DNA双链断裂和修复过程，揭示染色体修复过程的多样性。

  在研究过程中，研究团队为了解决CRISPR/dCas9示踪基因组DNA时背景噪音问题，他们构建了低背景、荧光响应的fCRISPR成像体系。为构建fCRISPR体系，团队将“荧光蛋白”探针改造成RNA响应的“荧光响应蛋白”，随后通过CRISPR/dCas9来标记目标DNA(图1A)。该团队设计构建成功的fCRISPR只有在结合到DNA靶标时，“荧光响应蛋白”才会发出荧光，在未结合到DNA靶标时“荧光响应蛋白”会被细胞蛋白酶体降解从而不发荧光(图1)。因此fCRISPR能够低背景、高信噪比和高灵敏地追踪活细胞中基因组DNA位点(图1)。

  基于fCRISPR成像体系，团队追踪到各类人源活细胞的染色体，以及不同低拷贝的基因组DNA位点。此外，fCRISPR可应用于多条染色体的正交成像，实时追踪染色体动力学，监测和对比癌变细胞端粒长度。最后，团队深入研究了染色体双链断裂（DSBs）及修复的过程，观察到染色体的重复切割与修复、同源重组修复等事件，时空研究了染色体DNA损伤及其修复后的生命活动。因此，该技术不仅对于研究疾病染色体的生物学机制和病理进展具有重要意义，并能够为疾病的治疗和诊断提供关键信息，以及为基于基因组DNA药物的靶点筛选提供有力帮助。

  研究生张钟轩和荣霄霄为该论文的共同第一作者，李幸研究员为本文的通讯作者。这项工作得到了国家自然科学基金项目，国家重点研发项目等基金的资助。

  原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45163-9.

图 1. fCRISPR染色体示踪体系。(a)团队针对传统持续发光荧光蛋白在标记DNA时造成的高背景、低灵敏度、低信噪比等问题，建立了高灵敏度fCRISPR示踪体系。(b-e)fCRISPR（红色，tdTomato-tDeg探针）降低了未标记DNA的荧光蛋白噪音，提升了DNA标记的信噪比，以实现高灵敏度示踪染色体。